Jesse nasceu na Austrália, ele tem três irmãos, Tarney, um cirurgião plástico ocular, Luke, um ortopedista e Polly, que faz estágio em medicina. Seus pais, Robyn e Rodney Spencer são os fundadores da Australians Against Further Immigration um partido político, eles já se candidataram várias vezes nas eleições federais e estaduais.
Spencer frequentou a Canterbury Primary School, Malvern Central School e a Scotch College, vindo a se formar em 1997.
Jesse foi noivo da atriz Jennifer Marie Morrison, que também participa(ou participava) da série House, M.D., como a Dra. Allison Cameron. Eles se conheceram no início das gravações, e se tornaram amigos. Começaram a namorar, mas não deram essa informação à mídia. No Emmy de 2006, admitiram o relacionamento e, em 23 de dezembro do mesmo ano, ficaram noivos. Após oito meses de noivado, o casal anunciou sua separação. Os motivos são desconhecidos. Atualmente, ele está namorando com a modelo, atriz e cantora pop inglesa, Louise Griffiths.
Spencer toca violino desde os dez anos de idade e também toca guitarra e piano.
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